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質粒載體構建

vector construction

實驗原理

質粒載體可以有效地運載外源基因片段進入受體細胞，可以獨立自主大量復制并且很容易從宿主細胞中分離純化，因而在分子生物學使用十分廣泛。常用的載體可分為克隆載體和表達載體，根據載體進入受體細胞的不同，分為原核細胞表達載體、真核細胞表達載體以及穿梭載體。

技術應用

目的基因的表達研究

基因、蛋白的功能研究

實驗流程

實驗結果展示

A                                                            B

    圖1 目的基因的載體構建電泳圖

A:目的片段的菌落PCR鑒定結果（泳道1-5：1-5號克隆的菌落PCR鑒定結果，其中1-3號樣本為菌落PCR陽性樣本，4-5號樣本為菌落PCR陰性樣本；泳道6：陽性對照；泳道7：陰性對照)。

B:目的片段的酶切電泳結果（目的片段的酶切電泳結果，載體片段5300bp，目的片段820bp）。

TROUBLESHOOTlNG

常見問題 FAQ

Q：如何看懂一個載體的質粒圖譜？

A：1）首先明確載體的功能是克隆載體還是表達載體，表達載體含有啟動子、終止等序列，原核表達載體常用T7啟動子、真核表達載體載體常用CMV啟動子。2）明確多克隆位點（MCS）有哪些酶切位點可用，插在該區域的外源基因可以像載體中的正常序列一樣進行復制和擴增。3）方便的篩選標記，原核抗性如氨、卡那，真核抗性如新霉素、嘌呤霉素。4）有哪些熒光標記或蛋白標簽序列。5）注意是否有其他功能元件。

Q ：方便追蹤目標基因表達的GFP的常見真核表達載體有哪幾種，各有說明區別？

A：可以提供pEGFP-C1和pIES2-EGFP三種載體選擇（EGFP中E代表Enhanced即經過改造的GFP，熒光強度得到加強，表達效率更高）。前兩種為EGFP的融合表達載體，分別在目的基因的N端和C端進行融合表達，后一種為目的基因與EGFP共表達的載體。

Q :酶切連接有哪些種類？

Q：plRES2-EGFP載體中的IRES序列的作用是什么？

A：IRES序列的全稱是內部核糖體進入位點序列（Internal Ribosome Entry Site）,一般真核mRNA的翻譯都需要5‘帽子來介導核糖體結合。微小RNA病毒家族則外例外，這類病毒在其mRNA前沒有帽子位點，但卻有600-1200bp的5‘非翻譯區，其中含有多個非起始AUG，這段長的非翻譯區即叫做IRES序列。IRES能招募核糖體對mRNA進行翻譯。在同一啟動子下，將目的基因（注意要加終止子）后加IRES及EGFP序列，IRES后的EGFP就能獨立地起始翻譯，可與目的基因共表達的作用，但表達量要低于目的基因，GFP熒光劑有可能會較弱。

Q：重組克隆的篩選鑒定方法有哪些？

參考文獻

1. J e a n Pe c c o u d. G e n e  S y n t h e s i s: M e t h o d s and Protocols. Humana Press,2012.

2. Benjamin Lewin. Genes IX [M]. Pearson Education,2007.