銳賽生物集團

穩轉株構建

Stable strain

實驗原理

在基因功能的研究中，將目的基因有效導入靶細胞，是功能研究的前提條件之一。根據不同的實驗需求可以選擇瞬時轉染/感染和穩轉細胞株構建。

瞬時轉染/感染的特點：外源DNA不整合到宿主的染色體中，一個宿主細胞中可以存在多個拷貝數，產生短時間內的高水平的表達(只能持續幾天)；外源基因的表達水平不存在整合位點的問題，不會受到周圍染色體元件的影響；瞬時轉染所需的人力和時間比穩轉少，但DNA攝入效率和表達水平在不同實驗中差異較大，因此表達不長久也不穩定。

穩轉細胞株的特點：經合適的藥物濃度進行藥物篩選后，可得到外源DNA整合到宿主染色體的細胞，這些細胞可以長時間表達外源目的基因，穩定表達細胞株彌補了瞬時感染(或轉染)實驗中外源基因表達時間短的缺陷，便于長期觀察。穩轉細胞的篩選需根據不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物，常用的抗性篩選有嘌呤霉素(puromycin)、潮霉素(hygromycin)、新霉素(neomycin)、滅稻瘟素(Blasticidin)等。若實驗需求構建穩轉細胞株，我們建議通過慢病毒感染細胞進行藥物篩選的方法，此方法較質粒轉染可以更加有效的將外源基因整合入基因組，且整合位點處于轉錄相對活躍的區域，從而獲得更加高效表達外源基因的穩轉株細胞。

技術應用

如秩序要觀察外源基因表達后較短時間內就能檢測的細胞功能，可使用瞬時轉染/感染。即在轉染后24至96小時內收獲細胞；如需要長期觀察外源基因表達的作用，進行長期藥理學研究、基因治療研究、遺傳調控機制研究或需要進行大規模蛋白合成則需要構建穩轉株。

實驗流程

實驗結果展示

圖 1 穩轉細胞株成功案例

TROUBLESHOOTING

常見問題 FAQ

Q：外源基因導入哺乳動物細胞的常見方法 有哪些？

A：外源基因導入哺乳動物細胞是目前基因治療的關鍵步驟，理想的方法應具備如下特點：高效、安全、低細胞毒性且方法簡單省時、經濟。常見方法及比較請見下表：

Q：如何選擇構建穩轉株還是瞬時轉染/感染？

A:根據外源基因能否整合宿主基因組DNA，可分為穩定轉染和瞬時轉染。如果需要觀察外源基因表達后較短時間內就能檢測的功能，可以使用瞬時轉染，即在轉染后24至96小時內收獲細胞；如果想長期觀察外源基因表達對于細胞功能的影響則需要構建穩轉株。穩定轉染需要進行細胞的篩選工作，與瞬時轉染相比時間長、工作量大，請根據實驗需求選擇合適的轉染方式。

Q：為什么推薦采用慢病毒感染而不是質粒轉染的方式構建穩轉株？

Q:如何確認靶細胞可以進行慢病毒介導的穩轉株構建?

A:首先對細胞進行慢病毒感染的MOI值摸索實驗,即確認慢病毒與細胞感染的合適比例,以進行后續穩轉株構建。將靶細胞接種至96孔板中,我們設定6-8個不同梯度的慢病毒MOI值感染靶細胞(進行加和不加polybrene的檢測),并取易感染的293細胞作為陽性對照。熒光顯微鏡下觀察靶細胞EGFP熒光率,拍照記錄各組MOI值下感染效率,確定感染效率達到80%以上的最佳MOI值。

Q:過表達穩定細胞株構建好之后,會出現qPCR及WB檢測目的基因沒有過表達的情況嗎?

A:我們會首先進行目的基因瞬時感染靶細胞后的qPCR和WB檢測,沒有問題再進行過表達穩定細胞株的藥物篩選工作。如果擔心抗體質量的問題沒有檢測到過表達建議客戶可以在靶蛋白上融合蛋白標簽。穩轉株構建經藥物篩選完成后如果aPCR和WB檢測沒有過表達，是不允許交貨到客戶手中的,即我們確保上海銳賽提供的穩定細胞株經過qPCR和WB確切驗證有明顯的外源基因表達。

Q:穩定細胞株靶蛋白經qPCR和WB檢測有過表達，但是相關功能未能得到陽性結果?

A:首先我們確保載體中靶蛋白對應的核苷酸序列經測序驗證序列正確,且閱讀框正確無誤,與標簽蛋白融合無誤,并且通過qPCR和WB的驗證,另外外源基因在哺乳動物細胞表達中一般都可以進行正確的轉錄翻譯,且翻譯后的蛋白能夠進行復雜的蛋白折疊和修飾,接近天然蛋白的結構。以上前提條件正確建立后,若蛋白本身未能獲得預期的功能,需要確認功能實驗的方法,比如是否設定陽性對照,實驗方案設計是否合理等,并且多查找相關文獻確認是否是有其他因素導致功能實驗未獲得陽性結果。

Q:收到的穩定細胞株,能夠維持多久?

A:客戶獲得的穩轉株一般需在藥物篩選濃度值的-半進行維持培養,一般可進行10代以內的檢測工作,建議客戶盡快進行相應的功能檢測實驗,不要反復凍存復蘇。如果長期培養不慎污染,或細胞狀態變差都會影響外源基因的表達。

Q:為什么同一種細胞的陰性對照穩轉株構建過程要快于目的基因的穩轉株構建過程?

A:外源蛋白的過量或內源蛋白的過低表達往往會影響到宿主細胞的生長狀態,因此往往陰性對照細胞的構建過程要快于外源基因的過表達或內源基因的RNAi穩轉株。

Q:單克隆穩轉株與混合穩轉株有何區別?

A:單克隆穩轉株是含有穩定整合外源片段的單個細胞的擴增,而混合穩轉株則是由多個單克隆穩轉核構成的克隆群,不同的單克隆其外源片段的整合位點不一樣,表達效率也不同。由于體外細胞多屬于病胞系,其基因組呈現不確定的特點,因此即使是同類細胞,不同細胞個體基因組背景都存在差異。當需要去除細胞群體干擾因素的時候,推薦使用單克隆穩定細胞株,其基因組背景相對單一,對實驗結果干擾因素小。當進行系統生物學研究時,多考慮這類因素。同時也是由于不同細胞個體差異大,而且不同整合位點的單克隆細胞株表現出來的細胞行為可能不一致,所以許多實驗使用混合克隆株更能去除細胞間差異造成的干擾。

參考文獻

1.R.Ian Freshney. Culture of AnimalCells:A Manualof Basic Technique and Specialized Applications[M].Wiley-Blackwell Press,2011.

2.David L.Spector,Robert D.Goldman, Leslie A. Leinwand.Cells:a Laboratory manual[M].Cold Spring Harbor Labrotary Press,1998.