銳賽生物集團

原位雜交（ISH）

In situ hybridization

實驗原理

將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。使用DNA或者RNA探針來檢測與其互補的另一條鏈在細菌或其他真核細胞中的位置。

RNA原位核酸雜交又稱RNA原位雜交組織化學或RNA原位雜交。該技術是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是：在細胞或組織結構保持不變的條件下，用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則，與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合（雜交），所形成的雜交體 (Hybrids）經顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位雜交技術 經不斷改進，其應用的領域已遠超出DNA原位雜交技術。尤其在基因分析和診斷方面能作定性、定位和定量分析，已 成為最有效的分子病理學技術，同時在分析低豐度和罕見的mRNA表達方面已展示了分子生物學的一重要方向。

原位雜交實驗步驟：前期胚胎的制備。

原位雜交第一天進行重新水化和固定、預雜交、雜交。

原位雜交第二天進行 1 將探針回收，放于－20C保存（通常探針可重復使用十次左右）2加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。3置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。4置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復一次。5用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。6室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時。  7  按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過夜。

原位雜交第三天進行1） 用1ml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。2） 用1ml 1mM**米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate（底物，用之前加5mM左旋米唑），十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色。4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定，拍照。6）4C冰箱保存。

原位雜交服務內容

1. 細胞特異性mRNA轉錄的定位，可用于基因圖譜，基因表達和基因組進化的研究；

2. 感染組織中病毒DNA/RNA的檢測和定位，如EB病毒mRNA、人類**狀瘤病毒和巨細胞病毒DNA的檢測；

3. 癌基因、抑癌基因及各種功能基因在轉錄水平的表達及其變化的檢測；

4. 基因在染色體上的定位；

5. 檢測染色體的變化，如染色體數量異常和染色體易位等；

6. 分裂間期細胞遺傳學的研究，如遺傳病的產前診斷和某些遺傳病基因攜帶者的確定，某些腫瘤的診斷和生物學劑量測定等。

   
   

實驗結果展示